1566年6月19日、メアリーは難産だったが無事ジェームズ（後のスコットランド王・イングランド王ジェームズ1世）を出産した。しかし、これでイングランドとスコットランド両国の国王になる夢が完全に絶たれたダーンリーは、息子の誕生を喜ばなかった。それどころか、自分の子か疑わしいとさえメアリーに対して言った。ルースベンにより頭に銃を突き付けられ、動いたら殺すと脅迫された上に、目の前で寵臣のリッチオを殺されると恐怖を味わわされたメアリーは、夫への愛情が完全に冷めてしまった。夫婦の修復は困難になっていた。